目前還有傳統(tǒng)做法仍然存在于HPLC的技術應用中,而這些做法其實非常不利于HPLC技術的效率提高、運行成本的降低以及運行時間的縮短。本文中將提出一些可行的傳統(tǒng)做法的替代方法,有些人可能會對這些替代方法出現(xiàn)爭議,但如果應用得當?shù)脑挘@些替代方法勢必會產生顯著的效果。因為相比不停地機械勞作,分析科學家應該更聰明地工作。
常見錯誤之一——色譜柱用粒徑5µm的顆粒填充
回想一下,多年來標準HPLC分析柱(250mm×4.6mm)都是采用5µm 粒徑顆粒填裝的,然而,事實上3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱(150mm×4.6mm)具有更好的分離效果及更短的分析時間。同時,現(xiàn)在許多實驗室標配的色譜儀是超高壓液相色譜(UHPLC)和液相色譜-質譜(LC-MS),所以色譜柱更應該換成3µm 或2µm 填裝的色譜柱。值得注意的是:3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱進口孔隙更小,更容易被“臟”的樣品堵塞。
常見錯誤之二——使用4.6mm內徑色譜柱(1mL/min)
自20世紀70年代初,HPLC分析柱的“標準”內徑就已經(jīng)是4.6mm了,而近年來,在努力減少溶劑消耗、節(jié)約樣品的目標下,許多實驗室已經(jīng)開始將3.0mm內徑的色譜柱作為更好的選擇,來代替使用4.6mm內徑色譜柱了。如果使用現(xiàn)代的中間分散HPLC的話,柱率和柱外頻帶展寬的效果通常不會受到任何負面影響??傊褂幂^小內徑的色譜柱是有利的,在梯度洗脫條件下可以獲得更高的分辨率。
常見錯誤之三——對HPLC的流動相進行過濾
通常經(jīng)凈化系統(tǒng)所得的HPLC級溶劑和水已經(jīng)足夠干凈了,如果我們再給它一次額外的過濾,那只會適得其反,引入不必要的化學污染。事實上,許多實驗室都有自己的一套色譜儀器保養(yǎng)維修計劃,每年對HPLC系統(tǒng)中的過濾器進行更換,所以我們沒有必要再對流動相進一步過濾。例外的是:如果你使用的是離子對試劑、低純度緩沖劑或高鹽含量的流動相時,仍然強烈建議你對流動相進行過濾。還有一種情況是有必要進行額外過濾的,即如果由于水源的質量不好或者其他原因導致從凈化系統(tǒng)流出的水不夠干凈的時候。
常見錯誤之四——使用緩沖劑流動相
當分析酸性或者堿性分析物的時候,有必要對流動相進行酸化或者堿化。簡單的流動相如含0.1%(體積比)甲酸的水溶液,僅需要將1mL甲酸定容到1升水中即可迅速制備。同樣,含0.1%(體積比)氨的水溶液可以用于多種高pH值兼容柱。當使用低硅羥基活性柱時,無論用低還是高pH值流動相運行,緩沖劑其實都很少用到,包括以流動相A為稀釋劑配制進樣樣品溶液時。例外的是:當分析復雜分子、復雜混合物時,可能仍然需要用緩沖劑流動相,以保持高的選擇性和特別適中的pH值的流動相。
常見錯誤之五——每次試驗都重新配制新的參考標準溶液
在藥品的質量控制實驗室中,往往每個試驗都會重新配制新的參考標準溶液,實際上這是沒有必要的。許多藥物在低溫和適當?shù)馁A存條件下溶液具有足夠的穩(wěn)定性。所以你可以一次性配制幾百個合格的參考標準溶液置于HPLC小瓶中,然后冷藏或冷凍貯存供以后分析用。而對于試驗結果的長期穩(wěn)定性研究來說,更應該采用由同一個原始溶液配制而成的標準溶液。當然,對于通常的試驗,標準溶液的儲存條件下的穩(wěn)定性(保質期)是應該經(jīng)過驗證的,并記錄配制時間。這里值得我們注意的是:所有的操作都需要做好記錄。
常見錯誤之六——對樣品瓶進行搖動
搖動(或反轉)樣品瓶會在樣品瓶蓋下面形成一層液體膜,這會對HPLC自動進樣器造成干擾以至于給出一個混亂的試驗結果。所以即使在排除了故障的情況下,也要始終警惕這一點。
例外的是:如果樣品是冷凍過的,那么解凍后,需要進行渦旋或搖動以確保樣品均勻。
常見錯誤之七——使用不銹鋼卡套作為柱的接頭
HPLC系統(tǒng)通常安裝有不銹鋼接頭和套圈,大多數(shù)情況下它們工作得都很好,但是它們不適合用于需要頻繁更換色譜柱時的連接。首先,不銹鋼卡套只能與為其量身定制的端部管接頭相匹配,而對于不同的色譜柱來說這種“量身定制”只會適得其反。
其次,預制的不銹鋼接頭只能夠重復密封5-10次。當某些制造商的不銹鋼接頭用于其他品牌的色譜柱時,由于不同端部接頭和插入深度的關系,這個問題會變得尤其明顯。一個可能的解決方案是使用可以用手指擰緊的聚醚醚酮(PEEK)管件,它們價格低廉,并且在5000psi(34.47MPa)壓力下的密封效果也很好。許多較新的UHPLC接頭,其額定壓力為20,000psi(137.9MPa),只需用手指擰緊,然后用扳手再轉四分之一圈就可以了。